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　　一、紅豆杉的現(xiàn)狀以及價值：

　　紅豆杉是常綠喬木，小枝秋天變成黃綠色或淡紅褐色葉條形，雌雄異株，種子扁圓形。種子用來榨油，也可入藥。屬淺根植物，其主根不明顯、側(cè)根發(fā)達，高30米，干徑達1米。葉螺旋狀互生，基部扭轉(zhuǎn)為二列，條形略微彎曲，長1～2.5cm，寬2～2.5mm，葉緣微反曲，葉的端緣漸尖，葉背有2條寬黃綠色或灰綠色的氣孔帶，中脈上密生有細小凸點，葉緣綠帶極窄，雌雄異株，雄球花常單生于葉腋，雌球花胚珠單生于花軸上部側(cè)生短軸的頂端，基部有圓盤狀的假種皮。種子扁卵圓形，有2棱，種卵圓形，假種皮杯狀，紅色。因為紅豆杉的樹皮有抗癌物質(zhì)——紫杉醇，所以有許多人進入林中來剝樹皮，使得紅豆杉的數(shù)量急劇下降。

　　價值：紅豆杉的藥用價值主要體現(xiàn)在它的提取物——次生代謝衍生物——紫杉醇。“紫杉醇最早是從短葉紅豆杉的種皮中分離出來的抗腫瘤活性成分。是治療轉(zhuǎn)移性卵巢癌和乳腺癌的最好藥物之一，同時對肺癌、食道癌也有顯著療效、對腎炎及細小病毒炎癥有明顯抑制。”紫杉醇的抗癌機理是：紫杉醇能與微量蛋白結(jié)合，并促進其聚合，抑制癌細胞的有絲分裂，有效阻止癌細胞的增殖。目前為了減少對野生紅豆杉資源的破壞，人們開始計劃用紅豆杉的枝徑葉部分，提取前體化合物10——去乙酰巴卡亭Ⅲ、然后用半合成辦法制備藥用紫杉醇。紫杉醇是目前世界上公認的廣譜、強活性、抗癌藥物、其具有獨特的抗癌機理。目前，紫杉醇已經(jīng)成為世界銷量第一的抗腫瘤藥物。同時國外又在做紫杉醇對阿爾茨海默氏病及其他癌癥方面的臨床試驗。當(dāng)前情況下，人類獲得紫杉醇的方法有：1、天然提取2、人工合成3、半人工合成4、生物發(fā)酵，而后三種方法大都停留在實驗室階段，所以紅豆杉的植物組織培養(yǎng)價值也就顯得尤為重要。

　　二、紅豆杉的組織培養(yǎng)技術(shù)

　?。ㄒ唬?、材料

　　較為適宜的組培外植體為新生的嫩枝，取材時間以每年的7、8月份為宜

　?。ǘ┡囵B(yǎng)過程

　　1、愈傷組織誘導(dǎo)用培養(yǎng)基

　　培養(yǎng)基的基本成分采用B5或MS的微量元素、有機物和鐵鹽，外加KNO32500mg/L,NH4NO3825mg/LKH2PO4240mg/L,MgSO4?7H2O370mg/L,CaCl2?2H2O660mg/L。添加的激素種類及數(shù)量為NAA0.8-1.0mg/L、BA0.3-0.5mg/L，調(diào)PH值為5.8-6.0；瓊脂粉和蔗糖用量分別為5.6-6.0g/L和30g/L。配置好的培養(yǎng)基用培養(yǎng)瓶分裝，經(jīng)高溫、高壓滅菌后備用。

　　2、材料消毒與接種

　　取新生的嫩枝（帶有針葉）放入加有0.02%洗潔精的自來水中浸泡10分鐘，浸泡過程中需經(jīng)常攪動，浸泡結(jié)束后用自來水沖洗10分鐘以上。將嫩枝轉(zhuǎn)入一干凈的三角瓶中。

　　以下所有操作必須在超凈工作臺上進行無菌操作。首先往三角瓶中加入75%的酒精，加入量應(yīng)為嫩枝體積的10倍以上，浸泡殺菌30-60秒，倒掉酒精，用無菌蒸餾水年漂洗一次；再將嫩枝轉(zhuǎn)入事先已高壓消毒的三角瓶中，加入15倍與嫩枝體積的0.1%的升汞溶液，浸泡殺菌5-8分鐘，浸泡過程中要不斷搖動，以使升汞與嫩枝充分接觸。為了達到徹底殺菌的效果，有人建議在升汞溶液中加入0.02%的表面活性劑，這樣可能更好一些，但要相對縮短殺菌時間。倒掉升汞溶液，用無菌蒸餾水沖洗4-6次，每次1-2分鐘，以徹底除去升汞。將嫩枝從三角瓶中分批取出，用無菌濾紙吸去材料表面的水分，將嫩枝切成0.5-0.8CM的小段，并切取部分針葉，嫩枝切段和針葉同時用作外植體，接種在誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基上。接種時要讓針葉的腹面接觸培養(yǎng)基，嫩枝的植物學(xué)近地端接觸培養(yǎng)基。注意用過的升汞溶液和沖洗液不要到處亂倒，以防重金屬污染。將接種好的培養(yǎng)物放置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度（25±2）℃，光照強度1500-2000lx，光照時間10h/d。

　　3、愈傷組織誘導(dǎo)

　　紅豆杉嫩枝和針葉在培養(yǎng)基上2-3周后即開始形成愈傷組織，約4-5周愈傷組織直徑可達1-2CM。不同種的紅豆杉和不同的外植體之間形成愈傷組織的比率、時間早晚和生長速度存在明顯差異，南方紅豆杉和東北紅豆杉的嫩枝切段出愈較快，出愈率分別為89%和70%，針葉出愈較慢，出愈率也較低，分別為36%和15%；普通紅豆杉出愈較慢但出愈率較高，嫩枝和針葉的出愈率分別為94%和30%。愈傷組織開始時為灰白色，隨著愈傷組織的增大，先期形成的愈傷組織顏色由灰白色變?yōu)樽厣@可能預(yù)示著愈傷組織在逐漸發(fā)生褐變，因此要及時給予注意，盡量保持較低的培養(yǎng)溫度和經(jīng)常更換培養(yǎng)基。當(dāng)愈傷組織生長到一定大小時即可轉(zhuǎn)入液體進行懸浮培養(yǎng)。

　　4、細胞懸浮培養(yǎng)與繼代

　　利用愈傷組織而不是用小苗或大樹來生產(chǎn)提取紫杉醇，是一條正在探索的途徑，如果成功則可以實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，從根本上解決紅豆杉資源不足的矛盾。因此，通過嫩枝和針葉培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織不需要進行芽分化的誘導(dǎo)，而是將愈傷組織直接轉(zhuǎn)入細胞懸浮培養(yǎng)。具體做法是將從嫩枝和針葉上產(chǎn)生的愈傷組織取下來直接轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基與上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同。在初次將愈傷轉(zhuǎn)到液體培養(yǎng)基即可適當(dāng)加入少量纖維素酶和果膠酶，以加快愈傷組織分離成單個細胞或小細胞團。

　　在初次懸浮培養(yǎng)階段可用50ml的小三角瓶，每瓶加10ml液體培養(yǎng)基，放入愈傷組織，在20-23℃的搖床上振蕩培養(yǎng)，光照條件與普通培養(yǎng)相同。每周需要更換一次培養(yǎng)基，更換時用5-10ml的平頭移液管將三角瓶中的愈傷組織、單個細胞或細胞團過濾出來，直接轉(zhuǎn)到新鮮的培養(yǎng)基中即可。在懸浮培養(yǎng)過程中應(yīng)隨時注意每一瓶中愈傷組織、細胞團生長的情況，挑選生長速度最快和特征最好的作為繼代的材料，毫不可惜的丟掉那些不好的（生長緩慢、顏色不正等）材料，這樣經(jīng)過幾代的選擇，就可以挑出符合理想的材料，作為懸浮系進行擴增培養(yǎng)。

　?。ㄈ┳仙即己康臋z測

　　現(xiàn)行的比較普遍有效的方法是利用薄層層析法，其大體過程是先將愈傷組織干燥，再用甲醇滲濾提取，獲得提取液，經(jīng)減壓濃縮至干，用水：CHCl3取。合并CHCl3部分，再經(jīng)減壓濃縮獲得粗提液，經(jīng)薄層層析，收取喊紫杉醇和10-脫乙?；涂ǘ?III的部分，再進行硅膠柱層析，分離收集相應(yīng)流分，減壓濃縮，TLC再次檢測，將含有紫杉醇的濃縮液進行二次柱層析，鑒定結(jié)果。另外，紅豆杉愈傷組織經(jīng)過一定分離提取后，可進行高效液相色譜層析（HPLC）分析，分析柱為4mm*250mm的C18柱，dp=10μm，分離體系為甲醇-乙腈-水（20：33：47）等速洗脫，流速為1ml/min。

　?。ㄋ模┙Y(jié)論

　　用植物組織培養(yǎng)這種先進的培養(yǎng)方法，能夠迅速、大量的生產(chǎn)出目前人類急需的紅豆杉，能夠為癌癥的治療提供很大的方便，社會以及積極效益都非常的明顯。

　　關(guān)于紅豆杉植物組織細胞培養(yǎng)中褐化的問題是當(dāng)前存在的一個重要問題，該現(xiàn)象與普通木本植物組培中出現(xiàn)的褐變不同。普通木本植物出現(xiàn)的褐變可通過選用較小的外植體、培養(yǎng)基中加活性炭、縮短繼代轉(zhuǎn)移周期、盡量少損傷外植體等措施加以克服，且以后不再發(fā)生。但是，利用上述方法解決紅豆杉的褐化問題收效甚微，這或許是因為紫杉醇本身對細胞生長具有毒害作用，其量的積累往往對細胞的增殖起抑制作用。如何解決提高細胞內(nèi)紫杉醇的含量而又不給細胞的生長帶來很大影響，使二者相協(xié)調(diào)一致，是目前解決的必要問題。